注： PE 和 APC 的完整操作步驟及標(biāo)記方案在后兩頁，如果不需要看介紹，可直接跳過
藻 紅 蛋 白 (R-PE 及 B-PE)
特 點(diǎn) ：
1.從紅藻中純化
2.具有極高的發(fā)射量子產(chǎn)率
3.熒光團(tuán)與蛋白質(zhì)主鏈共價(jià)結(jié)合，不被淬滅
4.高水溶性
R-PE 與 B-PE 的 區(qū) 別 ：
Wavelength (nm)
Wavelerngn (mm)
R-PE 與 B-PE 的 對 比 ：
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R-PE
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B-PE
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分子量
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240,000
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240,000
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*大吸收
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565 nm
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545 nm
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額外的吸收峰
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498 nm
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564nm
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*大發(fā)射
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573 nm
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573 nm
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消光系數(shù)(ε)
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1.96x106 M-1cm-1
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2.41x106 M-1cm-1
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熒光量子產(chǎn)率(QY)
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0.84
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0.98
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吸收比
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A566/A280≥5.0
A566/A498<1.5
A620/A566<0.01
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A545/A280≥5.5
A565/A496<2.7
A620/A545<0.01
|
特 點(diǎn) ：
1.從藍(lán)藻中純化
2.具有極高的發(fā)射量子產(chǎn)率
3.熒光團(tuán)與蛋白質(zhì)主鏈共價(jià)結(jié)合，不被淬滅
4.高水溶性
APC 和 C-PC 的區(qū)別：
APC 和 C-PC 的對比：
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APC
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C-PC
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分子量
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104,000
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264,000
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*大吸收
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651nm
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651nm
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*大發(fā)射
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662nm
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647 nm
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消光系數(shù)(?)
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7.3x105 M-1cm-1
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1.53x106cm-1M-1
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熒光量子產(chǎn)率(QY)
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0.68
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0.81
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吸收比
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A650/A620≥1.25
A650/A280≥4.5
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A652/A620<0.3
A620/A280>4
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交 聯(lián) APC 和 APC 的 對 比 ：
1.APC 結(jié)構(gòu)： 它具有α和β亞基，具有明顯的(αβ)3 四級(jí)結(jié)構(gòu)。
2.為什么要將APC 進(jìn) 行 交 聯(lián) ?
答 ：交聯(lián)是為了防止APC 在稀釋或暴露于變性鹽(如尿素或鹽酸胍) 時(shí)
發(fā)生可逆解離，從而保持其結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定。
3. 如何進(jìn)行 APC 交聯(lián)?
答：通過α和β亞基間的特異性 j聯(lián)可以阻止APC 的分解。
交聯(lián)比：>1.0
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NaClO4
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A650:A620
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CL-APC
|
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1.465849387
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CL-APC+NaClO4
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+
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1.386850153/
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|
NaClO4
|
A650:A620
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|
APC
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1.587272727
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APC+NaClO4
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+
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0.317901235
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注：圖中的紅色線條為沒有添加NaClO4, 藍(lán)色線條為添加了NaClO4。
如圖及表中信息所示， CL-APC 圖中添加NaClO4 及沒添加NaClO4, 吸收比沒有明顯變化。而在未交聯(lián)的APC
中， 添加NaClO4, 得到的吸收比有非常大的變化， 因?yàn)锳PC中加入了NaClO4 導(dǎo)致了它出現(xiàn)了解離。
特 點(diǎn) ：
1.存在于大多數(shù)光合作用的甲藻中
2.高水溶性
3.大斯托克斯位移
光 譜 特 性 ：
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PerCP
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分子量
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35,000
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*大吸收
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483nm
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*大發(fā)射
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676nm
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消光系數(shù)(ε)
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4.0x105 M-1cm-1
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熒光量子產(chǎn)率(QY)
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1.0
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亮度(exQY)
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4.9x105M-1cm-1
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吸收比
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A482/A280>4.0
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一 .P E 的 制 備
1.將 PE 純化。綴合前的濃度通常為 5-10 mg/ml 。 注意： PE 在綴合前作為 SAS ( 硫 酸 銨 鈉 ) 沉
淀物*穩(wěn)定。如果將 PE 以 SAS 沉淀物的形式儲(chǔ)存，則必須在使用前進(jìn)行大量純化。
2.使用3 .5毫克R-PE 修飾每毫克lgG, 包括在緩沖液交換過程中損失的額外10%。
3. 檢查 PE 的純度和濃度，請測量280、565 和 6 2 0 nm 處的吸光度。 (1 mg/ml 的 PE 在 565nm 處的 OD 為 8 . 2 ) 。 5 6 5 / 6 2 0 比 率 > 5 0 表示已充分去除污染的藻藍(lán)蛋白；565/280 比 率 > 5 表示已充分去除所有其他蛋白質(zhì)。
二 .P E 的 活 化
1.使用前在無水 DMSO 中制備 10 mg/ml 的 SMCC 儲(chǔ)備溶液。
2.每毫克 PE 加 入 1 1 μlSMCC, 并進(jìn)行渦旋。將反應(yīng)管用鋁箔包好，室溫下旋轉(zhuǎn)60 分鐘。
3.將純化的 PE 過凝膠過濾柱來交換緩沖液。
注意：對于失敗或效果較差的結(jié)合，增加或減少 SMCC 相對于 PE 的量，可能會(huì)有所好轉(zhuǎn)。
三 . 1gG 還 原
1.在蒸餾水中制備 1 M DTT(15.4 mg/100 μl) 的新鮮溶液。
2.1gG 溶液濃度應(yīng)為 4 mg/ml 或更高，這樣效果比較好。還原幾乎可以在任何緩沖液中進(jìn)行； MES 、 磷酸鹽和 TRIS 緩沖液 (pH 范圍為 6 至8)已被驗(yàn)證可以使用。如果抗體濃度低于 2 mg/ml, 則應(yīng)濃縮。緩沖液交換柱上的損失應(yīng)額外增加10%。
3.用 DTT 配制 20 mMlgG 溶液：每毫升 IgG 溶液加入 20μ lDTT 原液并攪拌。室溫下靜置30
分鐘，無需額外攪拌 (以盡量減少半胱氨酸再氧化為胱氨酸)。
4.將還原的lgG 通過預(yù)平衡的“交換緩沖液”過濾柱。收集0.25毫升的級(jí)分，測定蛋白濃度，并將含
有大部分lgG 的級(jí)分匯集在一起?？梢酝ㄟ^分光光度法或比色法完成。
5.此步驟后盡快進(jìn)行綴合。
注意：對于結(jié)合較差或失敗的情況，降低 DTT 濃度可能會(huì)有所幫助。
四 .進(jìn) 行 綴 合
1.每毫克 IgG 添 加 3.2 毫克 SMCC-PE。 用鋁箔包裹反應(yīng)管并在室溫下旋轉(zhuǎn)60 分鐘。注意：這些
摩 爾 比 ( 每 IgG 約 2 個(gè) PE) 效果很好。對于失敗或效果不佳的結(jié)合，不同的摩爾比可能會(huì)有所幫 助。
2.60 分鐘后，必須去掉 lgG 上未反應(yīng)的游離巰基。
3.在 1.0 ml 干 DMSO 中制備 10 mg NEM 的新鮮溶液。
4.每 毫 克 |gG 添加 34μ g(3.4μl) 。 室溫下包裹并旋轉(zhuǎn)20 分鐘。
2.60 分鐘后，必須去掉 lgG 上未反應(yīng)的游離巰基。
3.在 1.0 ml 干 DMSO 中制備 10 mg NEM 的新鮮溶液。
4.每毫克 |gG 添加 34μ g(3.4μl) 。 室溫下包裹并旋轉(zhuǎn)20 分鐘。
注1:整個(gè)綴合過程可以在 **內(nèi)完成。但是，綴合前對APC 的純化可能需要24-48小時(shí)。除了下面
列出的材料外，您還需要濃度至少為 2 mg/ml 的抗體溶液。請您在進(jìn)行APC 抗體綴合實(shí)驗(yàn)之前熟悉
如何使用脫鹽柱以及如何獲取吸光度光譜。
注 2 : SMCC-APC 綴合物非常穩(wěn)定(在“交換緩沖液”中，在4C 下至少可以穩(wěn)定幾個(gè)月)。因此， 如果您需要節(jié)省一部分時(shí)間，可以選擇同時(shí)綴合10 毫克或更多的 APC, 并將其用于幾次抗體實(shí)驗(yàn)(
在幾周內(nèi))。 SMCC-APC 的長期儲(chǔ)存*好是作為飽和硫酸銨沉淀物。
一 .A PC 的 制 備
1.將 APC 純化。綴合前的濃度通常為 5-10 mg/ml 。 注意： APC 在綴合前作為 SAS (硫酸銨鈉)
沉淀物*穩(wěn)定。如果將 APC 以 SAS 沉淀物的形式儲(chǔ)存，則必須在使用前進(jìn)行大量純化。在用每毫 升 1 升的“透析緩沖液”透析之前，用每毫升1 升 APC 的 PBS 進(jìn)行透析2 次。
2.使用1 .7毫克APC 修飾每毫克lgG, 包括在緩沖液交換過程中損失的額外10%。
3.檢查 APC 的純度和濃度，請測量280、620和655 nm 處的吸光度。 (1 mg/ml 的 APC 在 655nm 處的 OD 為 5 . 9 ) 。 655/620 比 率 > 1 . 4 表明雜質(zhì)被充分去除； 655/280 比 率 > 4 表 明所有其他蛋白質(zhì)均已充分去除
二 .A PC 的 活 化
1.使用前在無水 DMSO 中制備 10 mg/ml 的 SMCC 儲(chǔ)備溶液。
2.每毫克 APC 加 入 6 μlSMCC, 并進(jìn)行渦旋。將反應(yīng)管用鋁箔包好，室溫下旋轉(zhuǎn)60 分鐘。
3.將純化的 APC 過凝膠過濾柱來交換緩沖液。
注意：對于失敗或效果較差的結(jié)合，增加或減少 SMCC 相對于 APC 的量，可能會(huì)有所好轉(zhuǎn)。
三 . 1gG 還 原
1.在蒸餾水中制備 1 M DTT(15.4 mg/100 μl) 的新鮮溶液。
2.1gG 溶液濃度應(yīng)為 4 mg/ml 或更高，這樣效果比較好。還原幾乎可以在任何緩沖液中進(jìn)行； MES 、 磷酸鹽和 TRIS 緩沖液 (pH 范圍為 6 至8)已被驗(yàn)證可以使用。如果抗體濃度低于 2 mg/ml, 則應(yīng)濃縮。緩沖液交換柱上的損失應(yīng)額外增加10%。
3.用 DTT 配制 20 mMlgG 溶液：每毫升 IgG 溶液加入 20μ lDTT 原液并攪拌。室溫下靜置30
分鐘，無需額外攪拌 (以盡量減少半胱氨酸再氧化為胱氨酸)。
4.將還原的lgG 通過預(yù)平衡的“交換緩沖液”過濾柱。收集0.25毫升的級(jí)分，測定蛋白濃度，并將含
有大部分lgG 的級(jí)分匯集在一起?？梢酝ㄟ^分光光度法或比色法完成。
5.此步驟后盡快進(jìn)行綴合。
注意：對于結(jié)合較差或失敗的情況，降低 DTT 濃度可能會(huì)有所幫助。
四 .進(jìn) 行 綴 合
1.每毫克IgG 添加 1 . 5毫克 SMCC-APC 。 用鋁箔包裹反應(yīng)管并在室溫下旋轉(zhuǎn)60 分鐘。注意：這 些 摩 爾 比 ( 每 1gG 約 2 個(gè) APC) 效果很好。對于失敗或效果不佳的結(jié)合，不同的摩爾比可能會(huì)有所 幫助。
2.60 分鐘后，必須去掉 lgG 上未反應(yīng)的游離巰基。
3.在 1.0 ml 干 DMSO 中制備 10 mg NEM 的新鮮溶液。
4.每 毫 克 |gG 添加 34μ g(3.4μl) 。 室溫下包裹并旋轉(zhuǎn)20 分鐘。
1.
2.60 分鐘后，必須去掉 lgG 上未反應(yīng)的游離巰基。
3.在 1.0 ml 干 DMSO 中制備 10 mg NEM 的新鮮溶液。
4.每毫克 |gG 添加 34μ g(3.4μl) 。 室溫下包裹并旋轉(zhuǎn)20 分鐘。